Гистобактериоскопический и бактериологический методы исследования колонобиоптатов и характеристика пристеночной микрофлоры, как показатель биоценоза толстой кишки

Разнообразные неинфекционные воспалительные заболевания кишечника и "функциональные" расстройства (синдром раздраженной кишки), нередко сопровождаются изменениями микроэкологического гомеостаза. На современном этапе развития отечественной гастроэнтерологии проблема дисбиоценоза кишечника оценивается с новых позиций (Шептулин А.А., 1999). Этому вопросу посвящены многочисленные дискуссионные статьи о роли микрофлоры кишечника в обеспечении нормальной жизнедеятельности организма, а также о микробиологических аспектах диагностики нарушений биоценоза (Шендеров Б.А., 1998, Бондаренко В.М , 1998, Румянцев В.Г., Г999, Корнева Т.К., 1999, Циммерман Я.С., 2000)

Микрофлора кишечника в функциональном отношении делится на две основные группы: пристеночную и просветную. Просветная или транзиторная микрофлора входит в состав фекальной микрофлоры. Ее основными представителями являются аэробные и факультативно аэробные микроорганизмы, в основном представители семейства Enterobacteriaceae. Состав просветной микрофлоры непостоянен и варьирует в зависимости от характера питания, качества пищевых продуктов, функционального состояния кишеч ника, частоты стула. В связи с этим, бактериологическое изучение микро флоры фекалий по стандартной методике (Методические рекомендации МЗ СССР № 10-11/31 от 14.04.1986 г) - это исследование той части бактериаль ного спектра, которой либо уже нет, либо не будет в ближайшее время. Наи большее значение последнее обстоятельство имеет при трактовке результатов бактериологической посева кала при так называемых "функциональных" заболеваниях кишечника. В частности, при синдроме раздраженной кишки с диареей происходит постоянное "вымывание" просветной микрофлоры и вряд ли можно достоверно судить о каком-то ее постоянстве и, следователь но, о патологическом воздействии на слизистую оболочку.

Пристеночная микрофлора на 99% представлена неспорообразующими анаэробными и факультативно анаэробными бактериями (бифидо- и лактобактерии, бактероиды, молочнокислые стрептококки и др.) Пристеночная флора - "фиксированная". Представители нормальной микрофлоры прикреплены к поверхностным рецепторам эпителиальных клеток. Она более стабильна, пред ставляет собой устойчивую систему, разрушить которую довольно трудно.

Учитывая тот факт, что расселение популяций сапрофитов на протяже нии толстой кишки различно даже в норме (Микельсаар М.Э., 1990), а в фе кальном содержимом доминирует транзиторная микрофлора, а также трудно сти бактериологической оценки спектра пристеночной микрофлоры кишеч ника, весьма некорректно судить об изменениях в микробном ценозе только по результатам бактериологического исследования фекалий. В связи с этим, важно оценить именно пристеночную микрофлору толстой кишки. Осущест вить это можно как бактериологически, методом посева колонобиоптата на питательные среды, так и гистобактериоскопически при световой микроско пии окрашенных по специальной методике препаратов.

Гистобактериоскопический метод широко использовался в работах А.В. Цинзерлинга и его школы при изучении инфекционных болезней. Выявление микроорганизмов может осуществляться как в мазках, так и в гистологических срезах. Их количество, а также структура клеток ткани могут быть вы явлены с помощью различных методов окраски (Цинзерлинг А.В., 1993). Проблемы, возникающие при этом методе исследования, связаны с чисто тех ническими вопросами - отмыванием поверхностного слоя слизи с располо женными в ней микроорганизмами в процессе обработки биопсийного мате риала, в результате чего оценка микрофлоры становится невозможной или бесполезной.
Методы фиксации, позволяющие стабилизировать пристеночный слой слизи биоптата, разработаны для диагностики Helicobacter pylori (Морозов И.А., 1997, 1999). Предложена методика укрывания поверхности биоптата слоем агарового геля с целью предотвращения отмывания пристеночной сли зи при проводке материала для оценки степени обсемененности и взаимоот ношений бактерий с поверхностью слизистой оболочки желудка. Данная ме тодика использована для сохранения надэпителиальной слизи в колонобиоптатах. Предварительное погружение кусочка слизистой оболочки в подогре тый в микроволновой печи 1%-ный агаровый гель, приготовленный на сте рильном фосфатном буфере рН7,2-7,4, позволяет фиксировать слизь с нахо дящимися в ней микроорганизмами и сохранить его при дальнейшей провод ке и окраске биоптата. Слой агарового геля, в какой-то степени, создает и анаэробные условия для микроорганизмов во время доставки материала в бактериологическую лабораторию.

Для бактериологического посева использовали гомогенизат биоптированного кусочка слизистой оболочки толстой кишки в 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия. На первом этапе исследования предполагалось оценить только состав аэробной популяции микроорганизмов. Учет прово дился в колониеобразующих единицах (КОЕ) на плотных питательных сре дах в пересчете на 1 мл субстрата с последующей биохимической и серологи ческой идентификацией представителей семейства Enterobacteriaceae и дру гих условно патогенных бактерий.

Проводя гистобактериоскопическое исследование, количество микроор ганизмов в пристеночной слизи колонобиоптата оценивали полуколичест венным методом по аналогии с определением степени обсемененности H.pylori в гастробиоптатах. слабая степень обсемененности - до 20 микроб ных тел, средняя-20-50 микробных тел, сильная - свыше 50 микробных тел в поле зрения при увеличении х900 (масляная иммерсия).

В качестве модели для изучения пристеночной микрофлоры толстой кишки были выбраны колонобиоптата больных с диагнозом синдрома раз драженной кишки, у которых колоноскопия и биопсия проводилась в целях исключения опухолевого процесса, воспалительных заболеваний кишечника и др. В слизистой оболочке толстой кишки этих пациентов отсутствуют ярко выраженные структурные изменения, данные объекты можно принять за ус ловную норму (неизмененную слизистую оболочку).

Обследованы 70 пациентов в возрасте от 15 до 50 лет. Изучены 210 колонобиоптатов, полученных при фиброколоноскопии из слепой, поперечной ободочной и сигмовидной кишок. В 30 биоптатах слой пристеночной слизи казался десквамированньм. Гистобактериоскопическая картина при этом не верифицирована. В 180 препаратов пристеночный слой слизи был сохранен, что позволило подвергнуть их гистобактериоскопическому исследованию.

В биоптатах слизистой оболочки слепой кишки (51 образец) при иссле довании гистобактериоскопическим методом высокая степень обсемененности обнаружена в 28 случаях. Флора была представлена грамположительны ми тонкими палочками, расположенными короткими цепочками или параллельно (предположительно, лактобактерии) и плеоморфными по внешнему виду (предположительно, бифидобактерии). Грамотрицательные плеоморфные палочки (предположительно, бактероиды) отмечались практически в равных соотношениях с грамположительными представителями микроорга низмов. Грамположительные мелкие кокки, расположенные одиночно, выяв лялись в небольшом количестве. Наряду с ними, отмечалась слабая степень обсемененности небольшими грамотрицательиыми прямыми палочками, рас положенными отдельно или парами (предположительно, микроорганизмы семейства энтеробактерий). В 20 образцах описанные выше грамположительные и грамотрицательные палочки, морфологически сходные с лакто- и бифидобактериями и бактероидами определялись в умеренном количестве, а грамотрицательные палочки, морфологически сходные с энтеробактериями, также отмечались в небольшом количестве. Только в 4-х случаях грамотри цательные палочки семейства энтеробактерий вызывали высокую степень обсеменеиности при слабой степени колонизации слизистой оболочки пред ставителями нормальной микрофлоры.

При бактериологическом посеве биоптата слепой кишки отмечался рост полноценных штаммов кишечной палочки. В 9 биоптатах высевались кишеч ные палочки со сниженной ферментативной активностью, в 4 кишечные па лочки, обладающие гемолитической способностью, в 1 случае идентифициро ван росу культуры клебсиеллы.

Гистобактериоскопическое изучение биоптатов слизистой оболочки по перечной ободочной кишки позволило установить высокую степень обсеме ненности грамположительными и грамотрицательными палочками (предста вителями нормальной микрофлоры) в 16 случаях. При этом, представители семейства энтеробактерий вызывали слабую степень колонизации. В боль­шинстве случаев (42 колонобиоптата) бактерии, морфологически сходные с микроорганизмами нормальной микрофлоры, отмечались в умеренном коли честве, и в равном с ними соотношении присутствовали представители энте робактерий и грамположительные некрупные кокки небольшими цепочками (энтерококки). В 6 колонобиоптатах отмечалась высокая степень обсеменен ности грамотрицательными небольшими прямыми палочками с небольшим количеством грамположительных кокков, расположенных как цепочками (энтерококки), так и скоплениями (стафилококки). Сапрофиты в этих био птатах присутствовали лишь в небольших количествах.

Бактериологически высевались преимущественно представители нор мальной кишечной палочки. Наряду с ними, в 10 случаях идентифицированы кишечные палочки со сниженными ферментативными свойствами, а также гемолитические штаммы. В 7 случаях высевались представители условно пато генной микрофлоры (клебсиеллы, цитробактер, золотистый стафилококк).

В пристеночной слизи биоптатов сигмовидной кишки соотношение микроорганизмов выглядело следующим образом: из 65 биоптатов высокая степень обсемененности нормальной микрофлорой при слабой степени колонизации микроорганизмами семейства энтеробактерий отмечалась в 15 слу чаях, умеренная степень обсемененности грамположительными палочками при небольшом количестве грамотрицательных бактерий и грамположитель ных кокков в 32 биоптатах, в 18 образцах представители семейства энтеро бактерий преобладали над анаэробными микроорганизмами. Их количество оценивалось как высокая и слабая степени обсемененности соответственно. Наряду с этим, в 13 биоптатах в большом количестве присутствовали грамположительные стафилококки и в 2 случаях видны были почкующиеся клет ки дрожжеподобных грибов. В бактериологических посевах в равных соот ношениях присутствовали кищечные палочки со сниженной ферментативной активностью, гемолитические штаммы и представители нормальной кишеч ной палочки. Условно патогенная микрофлора высевалась в 13 случаях.

При параллельном бактериологическом исследовании просветной мик рофлоры фекалий по стандартной методике у 43 человек состояние кишечно го микробиоценоза было расценено как дисбактериоз 2-4 степеней. Однако, при гистобактериоскопическом исследовании лишь у 18-ти пациентов были выявлены нарушения состава пристеночной микрофлоры, заключающиеся в уменьшении количества представителей нормальной микрофлоры и заселе нии пристеночного слоя слизи преимущественно условно патогенными бак териями.

Бактериологическое изучение колонобиоптата не лишено тех же отри цательных моментов, что и исследование фекалий, хотя и в меньшей степени. К основным методическим трудностям следует отнести отсутствие селектив ных методов выделения и анаэробного культивирования неспороносных ана эробных бактерий. Например, в толстой кишке число некультивируемых, ана­эробных бактерий составляет 10 в 10 степени - 10 в 11 степени м.т на 1 г содержимого (Шендеров Б.А, 1998). Вторым негативным моментом является отсутствие разработан ных рекомендаций по количественной оценке выросших микроорганизмов, не рассчитаны нормы. Однако, несмотря на эти трудности бактериологиче ский посев колонобиоптата со слоем нативной слизи, колонизируемой имен но пристеночной, сапрофитной микрофлорой, представляется более репре зентативным исследованием в плане оценки состояния микробиоценоза тол стой кишки, чем посев фекалий с оценкой транзиторной микрофлоры.

Микрофлора кишечника сложилась в процессе эволюции человека, это результат многообразных приспособлений, адаптации микроорганизма к оби танию в макроорганизме (Красноголовец В.Н., 1989).

Основным энергетическим процессом для анаэробной группы микроор ганизмов пристеночной флоры является эволюционно самый древний меха низм - брожение, происходящий без участия кислорода. Донором и акцептором электронов служит органическое вещество. Кислород для этих бактерий либо токсичен, либо индиферентен. Строение слизистой оболочки кишечни ка с его ворсинками, криптами, слоем слизи, вырабатываемой бокаловидны ми клетками, является идеальным местом для создания условий анаэробиоза

Нормальная микрофлора, колонизирующая слизистую оболочку кишечника, эволюционно более древняя и занимает свою нишу. Одна из главных функций пристеночной микрофлоры - обеспечение колонизационной резистентности за счет экспрессии микроорганизмами разнообразных антогонистически активных, антибиотикоподобных веществ, органических ки слот, перикиси водорода, лизоцима, колицинов, блокаторов рецепторов и т д., предотвращающих адгезию к энтероцитам патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Известна также и другая важная функция сапрофитной микрофлоры - иммуномодулирующая, связанная с продукцией грамположительными бактериями мурамилдипептида, который оказывает стимулирующее влияние на фагоциты, и с воздействием О-антигена грамотрицательных бактерий на синтез иммунокомпетентными клетками секреторных иммуноглобулинов, цитокинов и интерферона (Бондаренко А.В. с соавт , 1998).

Кишечная пристеночная слизь, секреторные иммуноглобулины и сапрофитная флора совместно составляют преэпителиальную защиту, занимая углубления и возвышения, образуемые энтероцитами. Случайно попавшие в просвет кишечника патогенные микроорганизмы, или обитающие в нем условно патогенные бактерии продуцируют разнообразные эндо- и экзотокси ны. Путь токсинам до их специфических рецепторов преграждает биопленка слизистого барьера. При благоприятных условиях для массивного размноже ния патогенов существует реальная возможность проявления ими своих па тогенных свойств за счет адгезий к эпителиальным клеткам с последующей колонизацией слизистой оболочки.

Основным источником энергия для аэробных микроорганизмов просветной флоры служит окислительное фосфорилирование. Донором электро нов являются органические соединения биологического происхождения, ко торые в оптимальном количестве находятся в просвете кишечника.

Неблагоприятные факторы внешней среды, нарушения в питании, нера циональное использование антибиотиков, гормонотерапия и прочие негатив ные воздействия, ослабляющие неспецифическую и специфическую резистентность макроорганизма, способствуют формированию в желудочно-кишечном тракте хронического воспалительного процесса и сопутствующего дисбактериоза. Имея возможность контакта с энтероцитом (колоноцитом) в местах "прорыва", патогенньй микроорганизм запускает секрецию 3 типа (контактзависимая) - основной молекулярный механизм выживания и размножения в организме хозяина, общий для различных бактерий (Musser J М , 1996). Этот механизм отвечает за транспорт эффекторных молекул из цитоплазмы к по верхности бактерий, где при контакте они вызывают модификацию клеточных белков. Такие эффекторные молекулы выявлены у Yersinia, S flexneri, E coli (Ряпис Л.А., Липницкий А В, 1998). При повреждении слоя слизи, содержа щей IgA, происходит дегрануляция бокаловидных клеток с разрушением сапрофитной флоры (Droy M.T 1985). Так происходит замена биопленки из нормальной микрофлоры на биопленку из условно патогенных или патогенных микроорганизмов. При определенных условиях условно патогенные бактерии могут стать более конкурентными за сайты адгезий чем бифидо- и лактобактерии, а поскольку их связи с клетками чрезвычайно сильны, то появляется воз можность формирования очага эндогенной инфекции.
Таким образом, применение гистобактериоскопического метода иссле дования, наряду с морфологической оценкой колвнобиоптата, позволяет оце нить состав пристеночной микрофлоры, который отражает объективную кар тину состояния микробиоценоза, так как именно на этом участке происходит контакт микроорганизма с колоноцйтом. Этот метод, совместно с бактерио логическим посевом биоптата, возможно использовать для ориентировочной характеристики качественного состава пристеночной микрофлоры толстой кишки при комплексном клинико-лабораторном обследовании пациентов с кишечной дисфункцией.

Литература
1. Бондаренко А.В., Бондаренко Вл.М., Бондаренко В.М Пути совершенст вования этиопатогенетической терапии дисбактериозов. // Журн микробиол. -1998. - № 5. - С. 96 -101.
2. Дисбактериозы желудочно-кишечыого тракта / В.М. Бондаренко, Б.В. Боев, Е.А. Лыкова и др. // Рос журн. гастроэнтерол., гепатол, колопрокт. -1998. - №1.-C.61 - 63.
3. Коренева Т.К Дисбактериоз кишечника у проктологических больных мик робиологические аспекты. // Рос. журн гастроэнтерол, гепатол, коло прокт. - 1999. - № 3 -С. 55- 60.
4. Красногаловец В.Д. Дисбактериоз кишечника. - М.: Медицина, 1989. - 208 с.
5. Мюсельсаар М.Э. Формирование и сохранение резистентцой микрофлоры желудочно-кишечного тракта.//Труды ВНИИА. - М., 1990. -Вып 19 - С 26
6. Морозов И.А. Морфологические аспекты НР-ифекции в желудке //Пя тая сессия Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Материалы сессии. - Омск, 1997. -С. 62- 66. 7 Морозов И.А Проблемы морфологической диагностики Helicobacter pylon в желудке. // Рос. журн. гастроэнтерол гепатол; колопрокт - 1999 - №2. -С. 46 - 48.
8. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника: Метод, рекомендации / МЗ СССР. - М, 1986 - 23 с
9. Румянцев В.Г. Дисбактериоз кишечника клиническое значение и принципы лечения.//Рос журн. гастоэнтерол., гепатол, колопрокт - 1999 -№3 -С. 61 - 63.
10. Ряпис Л.А., Липницкий А В. Микробиологические и популяционно-генетические аспекты патогенности бактерий // Журн микробиол -1998. - № 6. -1 109-113
11 Цинзерлинг А.В. Современные инфекции. Патологическая анатомия и во просы патогенеза. Руководство. - Спб. Сотис - 1993 - 363с
12. Циммерман Я.С "Западноевропеизмы" и их место в современной русской медицинской терминологии, другие спорные терминологические проблемы //Клин. медицина. - 2000 - №1 - С 59 - 62
13 Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. // Рос журн. гастроэнтерол, гепатол, колопрокт - 1998 - № 1. -С. 61- 65.
14. Шептулин А.А. Синдром избыточного роста бактерий и "дисбактериоз кишечника": их место в современной гастроэнтерологии. // Рос. журн га строэнтерол., гепатол, колопрокт. - 1999. - № 3 - С 51 - 55

Кононов А.В., Миронова О.Н.
Омская государственная медицинская академия,
г. Омск