Несмотря на безусловные успехи современной противоопухолевой химиотерапии, проблема повышения эффективности лечения онкологических больных по-прежнему остается актуальной. Помимо высокой токсичности цитостатиков, которая ограничивает проведение адекватной химиотерапии, резистентность опухолей является серьезным препятствием в достижении желаемого эффекта терапии.
Один из наиболее распространенных типов резистентности – так называемая множественная лекарственная резистентность (MDR), когда появление устойчивости к одному из цитостатиков сопровождается резистентностью к другим лекарствам, отличающимся по структуре и механизму действия. Основной причиной развития этого типа резистентности является экспрессия обратного транспорта цитостатиков из опухолевых клеток, что приводит к снижению их внутриклеточного содержания и как результат – к уменьшению или отмене эффекта противоопухолевой терапии. Процесс осуществляется при участии транспортных белков, которые функционируют за счет энергии АТФ. Отсюда и название – АВС-транспортеры (АТР- binding cassette (ABC) transportes).
К противоопухолевым препаратам с перекрестной резистентностью (МDR – препараты) относятся антрациклины, винкаалкалоиды, и некоторые другие, то есть большинство эффективных цитостатиков. В большинстве опухолей множественная лекарственная резистентность является индуцированной (приобретенной), т.е. экспрессия АВС-транспортеров и потеря чувствительности к химиотерапии развиваются под воздействием лекарств, изначально эффективно убивающих опухолевые клетки. Что же касается опухолей толстой кишки, то им присуща врожденная множественная лекарственная резистентность, которая не связана с применением противоопухолевых препаратов, и выявляется уже в первичных опухолях.
Маркерами множественной лекарственной резистентности являются следующие АВС-транспортеры: Pgp (Р-гликопротеин), МRР (белок, ассоциированный с множественной лекарственной резистентностью), LRP и BCRP (белки, ассоциированные с резистентностью рака легкого и рака молочной железы соответственно) и другие еще неидентифицированные транспортеры. При этом важно заметить, что надежным прогностическим маркером MDR является именно функциональная активность АВС-транспортеров, а не просто наличие в клетке транспортных белков или экспрессия генов, их кодирующих.
Возникает естественный вопрос, почему же до настоящего времени этот показатель используется только для прогнозировании множественной лекарственной резистентности лейкозов, но не солидных опухолей? Почему до настоящего времени не изучена экспрессия функциональная активность АВС-транспортеров в солидных опухолях, хотя экспрессия транспортных белков и кодирующих их генов продемонстрирована во многих исследованиях?
Причина этого кроется в отсутствии методики проведения функционального теста в интактных образцах плотных тканей, что, по мнению ведущих специалистов, таких как Pinedo, Twentimman, Broxterman и др., которое полностью разделяем и мы, “препятствует не только пониманию тонких механизмов множественной лекарственной резистентности, но и разработке подходов к ее преодолению в солидных опухолях человека”.
Дело в том, что все разработанные методы позволяли проводить оценку функциональной активности АВС-транспортеров лишь в клеточных суспензиях. Получение же суспензии клеток из плотной ткани даже при использовании самых щадящих методик неизбежно приводит к неконтролируемому повреждению клеток и как следствие – к неконтролируемому искажению результатов тестирования функциональной активности белков, в том числе, и транспортных.
Мы сделали метод пригодным для оценки функциональной активности транспортных белков в солидных опухолях, изменив только способ определения внутри клеточного содержания препарата. Принципиально новым, позволяющим исследование интактной плотной ткани, явилось то, что внутриклеточное накопление препарата в реальном времени оценивается не по его содержанию в клетках, а по убыли препарата из среды инкубации. Это позволяет исключить этап получения суспензии клеток и использовать для исследования интактный образец солидной опухоли. В качестве модельного препарата мы применяем флуоресцирующий антрациклин доксорубицин, который является типичным представителем MDR-цитостатиков и субстратом всех известных транспортных белков, определяющих развитие множественной лекарственной резистентности. Это очень ценное качество доксорубицина, так как, по существу, он является универсальным тест-соединением, позволяющим оценивать состояние транспортной системы множественной лекарственной резистентности в целом.
Для выявления активности разных транспортеров используется ингибиторный анализ, т.е. в одном и том же образце опухоли сравнивается исходное внутриклеточное накопление доксорубицина с этим же показателем после воздействия на клетки специфического ингибитора какого-либо транспортера. Именно этот подход мы использовали при исследовании образцов рака толстой кишки (аденокарциномы) и нормальной слизистой, полученных во время операции 12 больных, из которых было 7 мужчин и 5 женщин в возрасте от 46 до 72 лет. Опухоль толстой кишки локализовалась в следующих отделах: слепая кишка – 1, восходящая кишка – 1, нисходящая и сигмовидная кишка – 8, верхнеампулярный отдел прямой кишки – 2. В ГНЦК выполнены хирургические вмешательства в объеме: правосторонняя гемиколэктомия – 2, левосторонняя гемиколэктомия – 1, резекция сигмовидной кишки – 7, передняя резекция прямой кишки – 2.
Оценка активности каждого из изученных АВС-транспортеров в нормальной и опухолевой ткани проведена в трех образцах одного и того же биопсийного материала. Изучена функциональная активность Pgp (ингибитор – верапамил), MRP (ингибитор – генистеин) и суммарная активность всех АВС-транспортеров в целом (ингибитор – азид натрия).
Первый и очень важный факт, который нам удалось показать – в нормальной слизистой и злокачественных опухолях толстой кишки выявляется функциональная активность АВС-транспортеров. Клеточная система обратного транспорта функционирует в 100% случаев рака толстой кишки и в 70% – в нормальной слизистой.
В опухолях толстой кишки экспрессия функциональной активности Pgp выявляется в половине случаев, тогда как MRP – в 2/3 исследованных опухолей. В нормальной слизистой толстой кишки частота экспрессии функциональной активности этих транспортеров приблизительно одинакова – около 50%. Иными словами, частота экспрессии функциональной активности Pgp в слизистой и опухолевой ткани приблизительно одинакова, тогда как функциональная активность MRP в раке толстой кишки экспрессируется чаще.
Кроме того, в исследованных образцах нормальной слизистой и рака толстой кишки выявлена экспрессия АВС-трапспортеров, отличных от Pgp и MRP. При этом в подавляющем большинстве опухолей толстой кишки определяется функциональная активность нескольких АВС-транспортсров: Pgp и MRP, Pgp и/или MRP и других АВС-транспортеров, отличных от Pgp и MRP.
Полученные данные свидетельствуют о том, что фенотип врожденной множественной лекарственной резистентности рака толстой кишки человека в подавляющем большинстве случаев определяется функционированием более чем одного транспортного белка. При этом спектр сочетаний экспрессии функциональной активности разных АВС-транспортеров, в разных опухолях толстой кишки различен. Более того, известно, что число АВС-транспортеров, которые могут определять фенотип врожденной множественной лекарственной резистентности, не ограничивается уже идентифицированными и по данным разных авторов их количество превышает 20. Функциональная активность, по крайней мере, части из них была выявлена в нашем исследовании. Они названы как АВС-транспортеры, отличные от Pgp и MRP.
Понятно, что преодолеть такую множественную лекарственную резистентность, вызванную функционированием нескольких транспортных белков, невозможно, используя лишь один специфический ингибитор АВС-транспортеров. Неэффективность такого подхода при лечении резистентных опухолей других локализаций уже неоднократно демонстрировалась в клинических исследованиях, однако, такие попытки, к сожалению, продолжаются. На наш взгляд, успешным может оказаться лишь воздействие на некую общую точку, которой, в частности, является энергетическая зависимость функционирования АВС-транспортеров. Конечно, энергетический яд азид натрия для этой цели не подходит, но можно думать, например, о препарате лонидамине, который ингибирует функцию любых АВС-транспортеров, уменьшая в клетке продукцию АТФ и подавляя процессы фосфорилирования. Обнадеживающие результаты преодоления множественной лекарственной резистентности при применении лонидамина в клинике уже получены.
Перспективным представляется и кратковременное нагревание опухоли (локальная гипертермия) и/или ограничение доступа глюкозы. Во всяком случае, в наших экспериментах эффект этих воздействий на образцы солидных опухолей был аналогичным воздействию азида натрия; внутриклеточное накопление доксорубицина увеличивалось в опухолях с фенотипом множественной лекарственной резистентности. Последнее очень важно, так как этот эффект мы не наблюдали в чувствительных опухолях (например, рак молочной железы). Поэтому речь может идти не об использования ингибирования АВС-транспортёров для повышения эффективности воздействия любых цитостатиков в отношении любой солидной опухоли, по только в отношении опухолей с фенотипом множественной лекарственной резистентности и только в отношении MDR-препаратов. Опухоли толстой кишки являются наиболее адекватной “моделью” для такого рода клинической оценки, так как полученные нами данные показывают, что фенотип множественной лекарственной резистентности экспрессирован в них в 100% случаев.
Однако, современная химиотерапия рака толстой кишки развивается в обход механизма множественной лекарственной резистентности; не по пути ее преодоления, а именно в обход. Например, модифицируются препараты платины, совершенствуется химиотерапия с использованием антиметаболитов. При этом большая группа эффективных противоопухолевых MDR-пренаратов, таких как антрациклины, подофилотоксины, винкаалкалоиды и таксапы практически полностью исключаются из арсенала лечебных средств рака толстой кишки. Нам это кажется стратегической ошибкой, так как возможность реализации их специфической активности на фоне ингибирования АВС-транспортеров, то есть выброса цитостатиков из клеток, представляется вполне реальной.
Сравнительная оценка функциональной активности АВС-транспортеров в нормальной слизистой и опухолях толстой кишки выявила ряд интересных фактов, которые позволяют высказать предположение о “происхождении” врожденной множественной лекарственной резистентности опухолей толстой кишки. Наиболее распространенным является представление о том, что экспрессия АВС-транспортеров, определяемая в нормальной слизистой толстой кишки, где они осуществляют защиту клеток от поступления в них токсических веществ, сохраняется в процессе малигнизации и “переходит” в опухолевые клетки. Однако при сравнительной оценке функциональной активности АВС-транспортеров в слизистой и опухолях толстой кишки одного и того же больного, нам не удалось подтвердить эту точку зрения.
Экспрессия функциональной активности Pgp, выявляемая в нормальной слизистой толстой кишки, более чем в 70% случаев, не определялась в опухолевой ткани того же больного, тогда как при выявлении функции MRP в слизистой, она сохраняется приблизительно в 70% опухолей. При отсутствии экспрессии Pgp или MRP в нормальной слизистой, экспрессия функциональной активности этих транспортеров в опухоли выявляется в половине случаев. Таким образом, в процессе малигнизации функция транспортных белков, экспрессированная в нормальных клетках, может как сохраняться, так и элиминироваться. Это приводит к тому, что качественно (то есть по спектру экспрессированных АВС-транспортеров) нормальная слизистая и опухоль одного и того же больного могут существенно отличаться. Поэтому при оценке возможной прогностической значимости функциональной активности АВС-транспортеров для предсказания злокачественности опухоли следует ориентироваться не на факт экспрессии функциональной активности того или иного транспортного белка, а на изменение его активности по сравнению с определяемой в нормальной слизистой того же больного.
Богуш Т.А., Жученко А.П., Калганов И.Д., Равчеева А.Б., Конухова А., Филон А.Ф., Богуш Е.А.
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, ГНЦ колопроктологии МЗ РФ, г. Москва, Россия